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山东试剂厂家核酸分离与纯化的技术路线设计

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山东试剂厂家核酸分离与纯化的技术路线设计

发布日期:2017-03-20 作者: 点击:

山东试剂厂家

(一)核酸的释放

正常情况下,无论是DNA还是RNA均位于细胞内,因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。细胞的破碎方法非常多,包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子,因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法,目前,大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高,方法温和,能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。

(二)核酸的分离与纯化

细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物,核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下,要从中分离出一定量的、符合纯度要求的核酸分子,并不是一件很容易的事情,这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上,利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的,包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物,非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质、多糖和脂类物质等;非需要的核酸分子,是指制备DNA时,RNA为污染物,制备RNA时,DNA为污染物,制备某一特定核酸分子时,其它的核酸分子均为污染物;至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子,由于对后继实验有影响,往往需要很好地去除。

(三)核酸质量与提取步骤的关系

一般地,分离纯化步骤越多,核酸的纯度也越高,但得率会逐渐下降,完整性也愈难以保证。相反,通过分离纯化步骤少的实验方案,我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子,但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。

(四)核酸的浓缩、沉淀与洗涤

随着核酸提取试剂的逐步加入,以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失,样品中核酸的浓度会逐渐下降,及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时,需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法,其优点在于核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度;另外,核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子,有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后,用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等,常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐,需用70%~75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品,可在有机溶剂沉淀前,采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。

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