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感受态细胞的制备及转化

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感受态细胞的制备及转化

发布日期:2017-04-10 作者: 点击:

感受态细胞制备及转化

材料、设备及试剂

一. 材料

DE3菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ???;PET载体: 购买,eppendorf管。

二。 设备

恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。

三. 试剂

1.LB固体和液体培养基:配方见第一章。

2.Amp母液:配方见第一章。

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4。麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌

感受态细胞

感受态制备

铺LB平板1个LB+KaNa平板两个及配50mlLB培养液(方法同前)

挑单菌落于3mlLB培养液中37℃130转/分震荡过夜

取0.5ml过夜菌加入50mlLB培养液中

37℃震荡2-3小时,活菌数〈108细胞/ml

(于2小时开始测OD值每20-30分钟测一次,OD600达到0。5-0。6即可)

无菌条件下转入用冰预冷的50ml离心管中,冰浴10分钟

4℃4000rpm 10min

弃上清,将管倒置1分钟流尽残留培养液

缓慢加入0.1M的用冰预冷的氯化钙10ml重悬菌体并冰浴20分钟

4℃4000rpm 10min

弃上清,将管倒置1分钟流尽残留培养液

加2ml0.1M的用冰预冷的氯化钙重悬菌体并分装为200μl/EP管-70℃保存

转化

1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

2、加入PET 溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

同时做两个对照:

对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。

四、 计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:

转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

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相关标签:感受态细胞,克隆载体

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