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为什么要先构建克隆载体再用表达载体

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为什么要先构建克隆载体再用表达载体

发布日期:2017-04-16 作者: 点击:

克隆载体

构建克隆载体是大量扩增DNA片段,用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作,构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。

 为什么要先构建克隆载体,再用表达载体,我猜是因为: 

 ①得到大量的DNA,虽然PCR也可以,但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR,而且每次都要重新提DNA和RNA才行,而且,PCR反应的试剂盒又不便宜,用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂(相对于PCR),成功率不是极高,而且还要筛选,但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌,你就可以保存了,你想什么时候用,摇个菌,就可以制备到大量的DNA。  

②测序需要。你想转表达,你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的,不要以为你设计了个特异性引物,然后跟你mark的长度就可以确定了,这也只是推测,在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许,要拿去测序,而一般送测的序列都是构建到载体上的序列,克隆载体上一般也都带有测序引物,已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。   

先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择,如果你的扩增PCR目的条带很亮,而且单一性很好,我建议你可以直接克隆进入表达载体。   

很多人选择先构建克隆载体,是因为在扩增基因时目的条带模糊,特异性不好,这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序,增加测序的准确度,从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物,直接送过去测序,往往导致测序信号峰很杂,有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解,而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。   

先构建克隆载体,一是为了便于测序,确认克隆序列正确,二是为了便于基因PCR片段的保存。

怎么构建克隆载体和表达载体?

首先根据你的实验需要选择相应的载体。  

其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点,切记在载体上所选择的酶切位点要和你的基因序列上相一致,并且这两个酶切位点在你的基因序列中并不存在,否则会将基因切断 再次就是对基因和载体进行酶切了,基因要是直接用带有酶切位点的引物进行PCR的话就不用再酶切了。酶切之后进行连接,一般都有连接试剂盒的。  

最后的重组质粒要转化至大肠杆菌中进行扩增,然后提取这个质粒进行酶切鉴定。

青岛科尚生物技术有限公司主营克隆载体、感受态细胞DNA marker蛋白marker蛋白提取试剂盒核酸提取试剂盒RNA提取试剂盒DNA提取试剂盒山东试剂公司RAININ移液器,欢迎致电:13853842152。

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