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细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明

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细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明

发布日期:2017-05-21 作者: 点击:

细菌基因组DNA提取试剂盒

细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明

产品简介: 本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,提取细菌基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料,能够高效专一吸附DNA.可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大,纯度高,质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作,包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤:使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 

1、取细菌培养液1ml,12000rpm离心1min.,尽量吸除上清。 

2、向菌体中加入200ul溶液A,振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮(如果是革兰氏阳性菌,可在此步骤加入终浓度为20mg/ml的溶菌酶),向悬浮液中加入20ul的RNaseA(10mg/ml),充分颠倒混匀,室温放置15-30min。 

3、向管中加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml),充分混匀,55℃消化30-60min,消化期间可颠倒离心管混匀数次,直至样品消化完全为止,此时可见菌液呈清亮粘稠状。 

4、向管中加入200ul溶液B,充分颠倒混匀,如出现白色沉淀,可于75℃放置15-30min,沉淀即会消失,不影响后续实验。如果溶液未变清亮,说明样品消化不彻底,可能会导致DNA的提取量以及纯度降低,还可能堵塞吸附柱。 

5、向管中加入200ul无水乙醇,充分混匀,此时还可能会出现絮状沉淀,不影响DNA的提取,可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中,静置2min。 

6、12000rpm离心2min.弃废液,将吸附柱放入收集管中。 

7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 

8、向吸附柱中加入600ul漂洗液,12000rpm离心lmin,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 

9、12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。 

10、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min,12000rpm离心1min。

11、离心所得洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心2min,即可得到高质量的细菌基因组DNA。 

注意事项: 

1、样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。 

2、若试剂盒中的溶液出现沉淀,可在65℃水浴中重新溶解后再使用,不影响提取效果。 

3、如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况,可适当延长离心时间。 

4、洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul,体积过小会影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。 

5、DNA浓度及纯度检测:得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/0D280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。

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