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感受态细胞的制作方法与意义

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感受态细胞的制作方法与意义

发布日期:2017-06-04 作者: 点击:

感受态细胞(competent cell):理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。

感受态细胞


制作方法

CaCl2法

1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀,同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞

细胞膜通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。

联合其它的二价金属离子(如Mn、Co)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍。

2.此时,将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激(90s),细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动,并随机出现许多间隙,外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

3。将转化后的细胞在选择性培养基上培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

电转法

电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便,愈来愈为人们所接受

意义

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达,不仅可以检验重组载体是否构建成功,最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验,如蛋白质表达纯化等工作。


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