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DNA提取试剂盒的步骤

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DNA提取试剂盒的步骤

发布日期:2019-01-01 作者: 点击:

DNA提取试剂盒

组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)  

储存条件  该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于 2-8℃。2-8℃保存条件下,若溶液产生沉淀,使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时 间,必要时可在37℃水浴中预热10 min,以溶解沉淀。   

处理材料  

1.用干烤过的镊子和剪刀剪取一定量的冰冻组织,体积约两个绿豆大小,放入 DNAase-free的1.5ml EP中。向EP管中加入等体积的磁珠,以及加入200 μl缓冲液GA,振荡悬浮。置于组织破碎仪中运行5mins/次,共3次。每破碎一次,需将含组织的EP管放入离心机中短暂离心来沉淀组织和磁珠,使其在下次破碎时更好的接触。可根据观察匀浆的效果来决定匀浆的次数,目标是“碾磨均匀”,不能有较大体积的组织块(>2mm的组织块)。  如果需要去除RNA,需加入4 μl RNaseA(100 mg/ml)溶液(客户自备,目录号:RT405-12),振荡15 sec,室温放置5 min。  

2.  加入20 μl Proteinase K溶液,混匀。提取组织基因组时,加入Proteinase K混匀后,在56℃放置1~3 h,直至组织溶解,每小时颠倒混合样品2-3次,用水浴振荡器也可。放入10,000rpm (~11,500×g) 的离心力高速离心1mins来沉淀未碾碎的组织和磁珠。将上清转移至新的EP管中。  

3.  加入200 μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10 min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意:加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。  

4.  加人200 μl 无水乙醇,充分振荡混匀15 sec,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。  

5.  将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中), 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。  

6.  向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD (使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。  

7.  向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇), 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 

8.  重复操作步骤7

9。将吸附柱CB3放回收集管中,12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置5mins,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μ(100ul)洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,12,000 rpm (~13,400×g)离心 2 min,将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA 的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室温放置2 min,12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min。  注意:洗脱缓冲液体积不应少于50 μl,体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于 7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。  

11. 溶解的DNA样品其 A260/280 比值< 1.7 ~ 1.9。将DNA溶液放入-20°C冰箱 中保存。


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